Статьи

Обнаружение вируса энтеббе летучей мыши через 54 года

  1. Таблица 1

Первоначально исследования вируса летучей мыши в Уганде были инициированы в середине 1950-х годов выделением вируса бешенства и нового флавивируса, который впоследствии стал известен как вирус Рио-Браво (Flaviviridae: Flavivirus ) из слюнных желез насекомоядных летучих мышей в Соединенных Штатах. 1 - 3 Впоследствии исследователи из Угандийского научно-исследовательского института вирусов (UVRI) собирали летучих мышей с чердака UVRI, иссекали слюнные железы и изолировали вирусы путем внутримозговой инокуляции экстрактов растертой слюнной железы новорожденным мышам. 4 , 5 Эта первая попытка привела к выделению вируса слюнной железы летучей мыши Энтеббе, штамма IL-30 (Flaviviridae: Flavivirus ), из маленькой летучей мыши с свободным хвостом ( Chaerephon pumilus ) (Cretzchmar). 4 , 5 Затем таксон был признан одним из его синонимов: Tadarida ( Chaerephon ) limbata (Peters). Люмсден и другие 4 , 5 определили, что этот изолят был новым флавивирусом с помощью серии тестов нейтрализации с использованием иммунной сыворотки против 20 арбовирусов, а также против вируса Рио-Браво. К 1964 году исследования по вирусам летучих мышей расширились в UVRI, и выборка из 1022 дополнительных летучих мышей позволила получить 14 штаммов вирусов, включая вирус летучей мыши Дакар (Flaviviridae: Flavivirus ), также из маленьких летучих мышей с свободным хвостом, и вирус летучей мыши Bukalasa (Flaviviridae: Flavivirus ) из Анголы летучие мыши со свободным хвостом ( Mops condylurus ) (А. Смит). 6 Выделение вируса летучей мыши на горе Элгон (Rhabdoviridae: Ledantevirus ) последовало вскоре после этого из красноречивой подковообразной летучей мыши ( Rhinolophus hildebrandtii eloquens ) (К. Андерсон), захваченной в Кении, с выделением и охарактеризованием вируса в УФРИ. 7 , 8 Дополнительные открытия вируса летучей мыши в Уганде позже включали вирус Касокеро (Bunyaviridae, неназначенный) из египетской фруктовой летучей мыши ( Rousettus aegyptiacus ) (Э. Жоффруа). 9 Вирус летучей мыши Энтеббе (ENTV, переименованный), вирус летучей мыши Букаласа и вирус летучей мыши Дакара были выделены из насекомоядных летучих мышей, захваченных на чердаке UVRI. 10 Серологические исследования показали, что распространенность инфекции ENTV в диких популяциях маленьких летучих мышей со свободным хвостом была высокой, но после первоначального открытия ENTV никогда не был снова изолирован. 10 , 11

Чтобы проконтролировать эти ранние исследования, в Уганде с 2011 по 2013 год проводился эпиднадзор за арбовирусными летучими мышами. Летучие мыши были выловлены на чердаках в нескольких местах вокруг Энтеббе и Кампалы в рамках более масштабной, общенациональной работы по отбору проб, о которой будет сообщено в других местах. Все захваты летучих мышей проводились с одобрения протокола 010-015 CDC / DVBD IACUC. Летучие мыши были пойманы на чердаках с помощью сетей тумана, с соблюдением соответствующих мер биобезопасности. При захвате летучих мышей помещали индивидуально в мешки для хранения ткани. Летучих мышей анестезировали галотаном, обескровливали с помощью пункции сердца и усыпляли передозировкой галотана и вывихом шейки матки. Кровь от летучих мышей собирали непосредственно в пробирки для отделения сыворотки, центрифугировали в поле и сразу же помещали в устройство для откачки сухого пара азота. Печень, селезенка, сердце, легкие и почки были собраны непосредственно в криопробирки и немедленно сохранены на сухом льду. В общей сложности 95 маленьких летучих мышей со свободным хвостом и 34 ангольских летучих мышей со свободным хвостом были пойманы в 2011 году, 15 маленьких летучих мышей со свободным хвостом в 2012 году и 70 маленьких летучих мышей со свободным хвостом в 2013 году.

Сначала была предпринята попытка выделения вируса из селезенки, и при положительном результате была также произведена изоляция вируса из оставшихся тканей, собранных у зараженной летучей мыши. Один вирус был выделен из 1 из 180 (0,5%) маленьких летучих мышей со свободным хвостом. Зараженной летучей мышью был взрослый мужчина, захваченный в Банга, Накивого (0 ° 04,884 'северной широты, 32 ° 27,030' восточной долготы) 23 июня 2011 года вблизи УВРИ. Инфекционный вирус был выделен из селезенки и легких; инфекционный вирус не был извлечен из сердца, печени или почек. Никакие другие ткани, оральные или фекальные мазки не были собраны у насекомоядных летучих мышей, отловленных в 2011 году. Первоначально изолят был идентифицирован как ENTV путем секвенирования ампликона флавивируса NS5 с использованием праймеров FU2 / CFD3, 12 с последующим секвенированием следующего поколения (NGS). Выделение вирусов, препаратов нуклеиновых кислот и NGS проводили, как описано ранее. 13 Новые праймеры были сконструированы из контигов, полученных из данных NGS с использованием программного обеспечения Primer 3 (Институт биомедицинских исследований Whitehead, Кембридж, Массачусетс) 14 ( Дополнительная таблица 1 ), и последовательность для всего генома была подтверждена прямым секвенированием. Последовательности концевых терминалов получали с использованием 5 ′ / 3 ′ RACE (FirstChoice® RLM-RACE, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Вирус-специфичные RACE-праймеры представлены в Дополнительная таблица 1 , В 5 'внешней реакции использовали праймер 514R в сочетании с 5' RACE внешним праймером. Во внутренних реакциях 5 'RACE использовали праймер 388R вместе с внутренним праймером 5' RACE; амплификация также была достигнута с праймерами 15F + 388R. В 3 'внешней реакции использовали либо праймер 9882F, либо 10328F в сочетании с 3' RACE наружным праймером. 3 'внутренняя гонка не удалась. Филогенетическое древо максимального правдоподобия было сгенерировано в MEGA версии 6.0 15 (Центр эволюционной медицины и информатики, Институт биодизайна, Tempe, AZ), использующий 10,493 нуклеотидов, охватывающих последовательность открытой рамки считывания избранных геномов флавивируса, доступных в GenBank (). Анализ был выполнен с использованием полной модели замещения делеции и 1000 повторных загрузочных копий.

Дерево максимального правдоподобия, основанное на последовательности открытой рамки считывания (полное удаление пропуска). Шкала указывает на нуклеотидные замены на сайт. Значения начальной загрузки> 50% показаны (1000 повторов). CFAV = вирус слияния клеток (NC001564); DENV1 = тип денге 1 ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "M87512", "term_id": "323660", "term_text": "M87512"}} M87512 ); DENV2 = тип денге 2 ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "M20558", "term_id": "323449", "term_text": "M20558"}} M20558 ); DENV3 = тип денге 3 ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "M93130", "term_id": "323468", "term_text": "M93130"}} M93130 ); DENV4 = тип денге 4 ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "AF326573", "term_id": "12659201", "term_text": "AF326573"}} AF326573 ); EHV = вирус Эдж-Хилла ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "DQ859060", "term_id": "146411782", "term_text": "DQ859060"}} DQ859060 ); ENTV = Энтеббе вирус летучей мыши ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "DQ837641", "term_id": "112818954", "term_text": "DQ837641"}} DQ837641 ); RBV = вирус Рио-Браво ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "JQ582840", "term_id": "383215103", "term_text": "JQ582840"}} JQ582840 ); SEPV = вирус сепика (NC008719); SLEV = вирус энцефалита Сент-Луиса (NC007580); СОКВ = вирус Соколук ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "NC_026624", "term_id": "765702601", "term_text": "NC_026624"}} NC_026624 ); TBEV = вирус клещевого энцефалита (NC001672); WNV = вирус Западного Нила ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "DQ211652", "term_id": "77166600", "term_text": "DQ211652"}} DQ211652 ); WSLV = Вессельбронский вирус ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "DQ859058", "term_id": "146411778", "term_text": "DQ859058"}} DQ859058 ); YFV = вирус желтой лихорадки ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "K02749", "term_id": "336192", "term_text": "K02749"}} K02749 ); YOKV = вирус йокозы (NC005039); ZIKV = вирус Зика ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "AF013415", "term_id": "2731554", "term_text": "AF013415"}} AF013415 ).

Всего было получено 10 663 нуклеотида генома ENTV (номер доступа в GenBank {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "KP233893", "term_id": "873167403", "term_text": "KP233893"}} KP233893 ), из которых полипептид кодируется между нуклеотидами 120 и 10,355. Куно и Чанг 16 опубликован единственный другой существующий геном ENTV ( {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "DQ837641", "term_id": "112818954", "term_text": "DQ837641"}} DQ837641 ) секвенирован из исходного штамма IL-30. По сравнению с этой исходной последовательностью мы сообщаем о дополнительных 153 нуклеотидах в 3'-некодирующей области, но также столкнулись с трудностями при получении полной 3'-концевой последовательности. 16 В полипептидной последовательности было 76 аминокислотных замен, что привело к идентичности 97,8% на уровне аминокислот между изолятами 1957 и 2011 гг. Перед секвенированием изолят 1957 года был пассирован в мозге сосущей мыши, но более ранняя история пассажа неясна; изолят 2011 года дважды пассировали в клетках Vero. Эта дивергенция аминокислот в 2,2% находится в пределах диапазона, который наблюдался для других флавивирусов с разницей в интервале от 1 до 49 лет, 17 - 19 что указывает на относительно небольшое изменение в геноме ENTV за 54 года с момента первой изоляции.

Каждый ген имел по крайней мере одну замену аминокислоты, за исключением PrM и M (). Наибольшая процентная дивергенция между двумя изолятами была в NS4A, 10,3% (). NS4A является небольшим многофункциональным гидрофобным белком, который играет роль в модулировании ответа интерферона I типа хозяина. 20 Также было показано, что он связывается с клеточным хозяином виментина во время репликации вируса денге для стабилизации репликационного комплекса. 21 Функциональное значение этого высокого процента расхождения аминокислот еще предстоит определить, но Хан и другие 22 предположил, что большое количество аминокислотных замен может быть размещено среди небольших гидрофобных полипептидов NS2A, NS2B, NS4A и NS4B, пока профиль гидрофобности остается неизменным. В этом случае изменения профиля гидрофобности NS4A между этими двумя изолятами были несущественными. Два из 76 аминокислотных изменений произошли в соединениях NS2A / NS2B и в NS4A / 2K. Длины всех генов были идентичны тем, о которых сообщалось ранее. 16

Таблица 1

Длина гена (aa) Количество замен aa (%) C 119 6 (5,0) PrM 93 0 (0,0) M 75 0 (0,0) E 489 5 (1,0) NS1 353 11 (3,1) NS2A 228 9 (3,9) NS2B 130 1 (0,8) NS3 620 7 (1,1) NS4A 126 13 (10,3) 2K 23 1 (4,3) NS4B 249 6 (2,4) NS5 906 17 (1,9)

Филогенетические отношения между ENTV и вирусом желтой лихорадки (YFV) очень интересны, так как YFV исторически является одним из наиболее важных с медицинской точки зрения флавивирусов, переносимых комарами. Хотя ENTV филогенетически относится к флавивирусам, переносимым комарами, и исторически относится к группе YFV, 16 , 23 он был выделен только дважды от летучих мышей (1957 и 2011) и никогда от комаров или людей, пойманных в дикой природе. подтверждает филогенетическое расположение обоих изолятов ENTV, как опубликовано ранее, 12 , 16 , 23 а также поддерживает недавнее размещение Международного комитета по таксономии вирусов ENTV в группе вирусов летучих мышей Entebbe, родственной группе YFV. 24 В соответствии с этой новой группировкой ENTV поделилась наиболее близкой гомологией последовательности с вирусом Соколук, который был выделен из насекомоядных летучих мышей и мягких клещей в Кыргызстане. 25 Эксперименты на патогенность не проводились в рамках этого исследования, но первоначально было показано, что ENTV является патогенным для взрослых мышей при интрацеребральном введении и для мышей-младенцев как внутримозговым, так и внутрибрюшинным путями. 4 , 5 По нашему опыту, это вызывало цитопатические эффекты и вызывало появление бляшек на клетках Vero. ENTV также размножается в клетках комаров. 26 Несмотря на то, что более полувека оставаясь малоизвестным вирусом, связанным с летучими мышами, ENTV продолжает циркулировать среди маленьких летучих мышей с свободным хвостом в Уганде. Дальнейшее изучение этого вируса позволит получить ценную информацию об экологических и генетических факторах, регулирующих эволюцию и передачу флавивирусов, переносимых летучими мышами и комарами.

2011.11.19
Карта